C’est au XVIe siècle que l’expression « Sainte-nitouche » apparaît dans Gargantua, œuvre majeure de François Rabelais, sous la formulation « Saincte Nytouche ! » quand l’auteur évoque plusieurs saints :

Croiez que c’estoit le plus horrible spectacle qu’on veit ocnques, les uns cryoient saincte Barbe ; les aultres sainct georges ; les aultres saincte Nytouche, les aultres nostre Dame de Cunault, de Laurette, de bonnes nouvelles, de la lenou, de la rivière.
François Rabelais, Gargantua, chapitre XXVII

Le terme « nytouche » est en fait dérivé d’un jeu de mots, un calembour, dérivé d’une déformation phonétique. Il s’agit d’un raccourci pour dire « on n’y touche pas » et donc phonétiquement « on nitouche pas » ; « nitouche » désignant l’individu qui n’a pas l’air d’y toucher.

Une sainte nitouche est donc, comme le précise Alain Rey, dans son dictionnaire 200 drôles d'expressions, une « Sainte qui n'y touche pas ».